Б. Необратимое ингибирование

Необратимое ингибирование наблюдают в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента. В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.

Диизопропилфторфосфат (ДФФ) специфически реагирует лишь с одним из многих остатков серина в активном центре фермента. Остаток Сер, способный реагировать с ДФФ, имеет идентичное или очень сходное аминокислотное окружение. Высокая реакционная способность этого остатка по сравнению с другими остатками Сер обусловлена аминокислотными остатками, также входящими в активный центр ферментов.

ДФФ относят к специфическим необратимым ингибитором «сериновых» ферментов, так как он образует ковалентную связь с гидроксильной группой серина, находящегося в активном центре и играющего ключевую роль в процессе катализа.

Монойодуксусная кислота , п-хлормеркурибензоат легко вступают в реакции с SH-группами остатков цистеина белков. Эти ингибиторы не относят к специфичным, так как они реагируют с любыми свободными SH-группами белков и называются неспецифическими ингибиторами. Если SH-группы принимают участие непосредственно в катализе, то с помощью этих ингибиторов представляется возможным выявление роли SH-групп фермента в катализе.

Необратимые ингибиторы ферментов как лекарственные препараты

Пример лекарственного препарата, действие которого основано на необратимом ингибировании ферментов, - широко используемый препарат аспирин . Противовоспалительный нестероидный препарат аспирин обеспечивает фармакологическое действие за счёт ингибирования фермента циклооксигеназы , катализирующего реакцию образования простагландинов из арахидоновой кислоты. В результате химической реакции ацетильный остаток аспирина присоединяется к свободной концевой ОН-группе серина циклооксигеназы.

Это вызывает снижение образования продуктов реакции простагландинов, которые обладают широким спектром биологических функций, в том числе являются медиаторами воспаления.

Обратимое ингибирование

Обратимые ингибиторы связываются с ферментом слабыми нековалентными связями и при определённых условиях легко отделяются от фермента. Обратимые ингибиторы бывают конкурентными и неконкурентными.

Конкурентное ингибирование

К конкурентному ингибированию относят обратимое снижение скорости ферментативной реакции, вызванное ингибитором, связывающимся с активным центром фермента и препятствующим образованию фермент-субстратного комплекса. Такой тип ингибирования наблюдают, когда ингибитор – структурный аналог субстрата, в результате возникает конкуренция молекул субстрата и ингибитора за место в активном центре фермента. В этом случае с ферментом взаимодействует либо субстрат, либо ингибитор, образуя комплексы фермент-субстрат (ES) или фермент-ингибитор (EI). При формировании комплекса фермента и ингибитора (EI) продукт реакции не образуется.

Классический пример конкурентного ингибирования – ингибирование сукцинатдегидрогеназной реакции малоновой кислотой. Малоновая кислота – структурный аналог сукцината (наличие двух карбоксильных групп) и может также взаимодействовать с активным центром сукцинатдегидрогеназы. Однако отщепление двух атомов водорода от малоновой кислоты невозможно; следовательно, скорость реакции снижается.

Изменение каталитической эффективности ферментов

Индуцируемыми, как правило, являются ферменты с катаболической функцией. Их образование может быть вызвано или ускорено субстратом данного фермента. Репрессируемыми обычно бывают ферменты анаболической направленности. Ингибитором (репрессором) синтеза этих ферментов может быть конечный продукт данной ферментативной реакции.

Этот тип регуляции может осуществляться по нескольким механизмам.

Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов

Активаторы разными путями могут повышать ферментативную активность:

Формируют активный центр фермента;

Облегчают образование фермент-субстратного комплекса;

Стабилизируют нативную структуру фермента;

Защищают функциональные группы активного центра.

Классификация ингибиторов ферментов :

1. Неспецифические.

2. Специфические:

а) необратимые

б) обратимые:

Конкурентные

Неконкурентные.

Неспецифические ингибиторы вызывают денатурацию молекулы фермента – это кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов. Их действие не связано с механизмом ферментативного катализа.

Необратимые ингибиторы ферментов как лекарственные препараты

Некоторые вещества вызывают необратимое ингибирование ферментов . Рассмотрим два примера такого рода.

Очень малые концентрации ионов тяжелых металлов, например ионов ртути (Hg2+), серебра (Ag+) и мышьяка (As+), а также определенные иодсодержащие соединения полностью ингибируют некоторые ферменты . Эти вещества необратимо соединяются с сульфгидрильными группами (-SH) в молекуле фермента (рис. 4.13), причем сульфгидрильные группы могут находиться как в активном центре фермента, так и вне его. В любом случае структура фермента нарушается и он теряет способность осуществлять катализ. Может произойти и осаждение ферментного белка.

Другой пример необратимого ингибирования - действие диизопропилфторфосфата (ДФФ), соединения из группы нервно-паралитических отравляющих веществ. ДФФ связывается с остатком аминокислоты серина, находящимся в активном центре фермента ацетилхолинэстеразы. Этот фермент инактивирует ацетилхолин, играющий роль нейромедиатора. Одна из функций ацетилхолина заключается в обеспечении передачи нервного импульса от одного нейрона к другому через синаптическую щель.

Почти сразу после передачи очередного импульса ацетилхолинэстераза инактивирует ацетилхолин , расщепляя его молекулы. Если адетилхолинэстераза ингибирована , то ацетилхолин накапливается, нервные импульсы следуют один за другим, и мышца длительное время не расслабляется. В конце концов наступает паралич, а может наступить и смерть, поскольку затронутыми оказываются также мышцы грудной клетки, в результате чего происходит остановка дыхания. Некоторые из применяемых в настоящее время инсектицидов (например, паратион) оказывают такое же действие на насекомых. Нервную и мышечную системы человека они тоже способны повреждать.

Аллостерические ферменты

Один из самых обычных способов регуляции метаболических путей - это регуляция с помощью аллостерических ферментов . Аллостерическими называют ферменты, действие которых «по определению» связано с изменением формы (alios - иной, другой; stereos - форма).

Активность таких ферментов регулируют вещества, действующие подобно неконкурентным ингибиторам . Эти вещества присоединяются к ферментам в особых участках, удаленных от активного центра, и меняют активность фермента, вызывая обратимое изменение в структуре активного центра.

В результате меняется и способность субстрата связываться с ферментом (чем данное явление и отличается от неконкурентного ингибирования ). Действующие таким образом вещества называются аллостерическими ингибиторами. Рисунок поясняет механизм аллостерического ингибирования.

Примером данного явления служит реакция, протекающая во время гликолиза, который составляет одну из стадий клеточного дыхания. Клеточное дыхание служит источником АТФ. Если концентрация АТФ высока, то АТФ, действуя как аллостерический ингибитор, подавляет активность одного из ферментов гликолиза. Если же клеточный метаболизм усиливается, а следовательно, АТФ расходуется и его общая концентрация падает, то после того как ингибитор будет удален, данный метаболический путь снова вступает в действие. Это может также служить примером ингибирования конечным продуктом.

Необратимое ингибирование наблюдают в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента, В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.

К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например ртути (Hg 2+), серебра (Ag +) и мышьяка (As 3+), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра. Субстрат при этом не может подвергаться химическому превращению. При наличии реактиваторов ферментативная функция восстанавливается. В больших концентрациях ионы тяжёлых металлов вызывают денатурацию белковой молекулы фермента, т.е. приводят к полной инактивации фермента.

1. Специфические и неспецифические
ингибиторы

Использование необратимых ингибиторов представляет большой интерес для выяснения механизма действия ферментов. С этой целью применяют вещества, блокирующие определённые группы активного центра ферментов. Такие ингибиторы называют специфическими. Ряд соединений легко вступает в реакции с определенными химическими группами. Если эти группы участвуют в катализе, то происходит полная инактивация фермента.

2. Необратимые ингибиторы ферментов как
лекарственные препараты

Пример лекарственного препарата, действие которого основано на необратимом ингибировании ферментов, - широко используемый препарат аспирин. Противовоспалительный нестероидный препарат аспирин обеспечивает фармакологическое действие за счёт ингибирования фермента циклооксигеназы, катализирующего реакцию образования простагландинов из арахидоновой кислоты. В результате химической реакции ацетильный остаток аспирина присоединяется к свободной концевой NH 2 -группе одной из субъединиц циклооксигеназы.

Аллостерическая регуляция активности ферментов. Роль аллостерических ферментов в метаболизме клетки. Аллостерические эффекторы и ингибиторы. Особенности строения и функционирования аллостерических ферментов и их локализация в метаболических путях. Регуляция активности ферментов по принципу отрицательной обратной связи. Привести примеры.

Наиболее тонким и широко распространенным способом регуляции активности ферментов является аллостерическая регуляция . В этом случае регуляторный фактор связывается не с каталитическим центром фермента, а с другим его участком (регуляторным центром ), что приводит к изменению активности фермента. Ферменты, регулируемые таким образом, называются аллостерическими , они часто занимают ключевую позицию в метаболизме. Вещество, связывающееся с регуляторным центром называется эффектором , эффектор может быть ингибитором , а может быть активатором . Обычно эффекторами бывают либо конечные продукты биосинтетических путей (ингибирование по принципу обратной связи), либо вещества, концентрация которых отражает состояние клеточного метаболизма (АТФ, АМФ, НАД+ и др.). Как правило, аллостерические ферменты катализируют одну из реакций, с которой начинается процесс образования какого-то метаболита. Обычно эта стадия лимитирует скорость всего процесса в целом. В катаболических процессах, сопровождающихся синтезом АТФ из АДФ, в роли аллостерического ингибитора одной из ранних стадий катаболизма часто выступает сам конечный продукт – АТФ. Аллостерическим ингибитором одной из ранних стадий анаболизма нередко служит конечный продукт биосинтеза, например какая-нибудь аминокислота.

Активность некоторых аллостерических ферментов стимулируется специфическими активаторами. Аллостерический фермент, регулирующий одну из катаболических последовательностей реакций, может, например, подчиняться стимулирующему влиянию положительных эффекторов – АДР или АМР и ингибирующему действию отрицательного эффектора – АТР. Известны также случаи, когда аллостерический фермент какого-нибудь метаболического пути специфическим образом реагирует на промежуточные или конечные продукты других метаболических путей. Благодаря этому оказывается возможной координация скорости действия различных ферментных систем.

Использование необратимых ингибиторов представляет большой интерес для выяснения

Бесконкурентное ингибирование. При бесконкурентном ингибировании ингибитор связывается только с фермент-субстратным комплексом , но не со свободным ферментом. Субстрат, связываясь с ферментом, изменяет его конформацию, что делает возможным связывание с ингибитором. Ингибитор меняет конформацию фермента таким образом, что катализ становится невозможным. Для него характерно то, что V и Км изменяются в одинаковой степени.

Ингибирование субстратом - частный случай бесконкурентного ингибирования, когда две молекулы субстрата связываются с ферментом, что препятствует образованию продукта.

Аллостерическое ингибирование: ингибиторы связываются с отдельными участками фермента вне активного центра. Такое связывание влечет за собой конформационные изменения в молекуле фермента , которые приводят к уменьшению его активности . Аллостерические эффекты встречаются практически только в случае олигомерных ферментов. Кинетику таких систем нельзя описать с помощью простой модели Михаэлиса-Ментен.

Необратимое ингибирование наблюдают в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента . Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента, В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию .

К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например ртути (Hg 2+), серебра (Ag +) и мышьяка (As 3+), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра. Субстрат при этом не может подвергаться химическому превращению. При наличии реактиваторов ферментативная функция восстанавливается . В больших концентрациях ионы тяжёлых металлов вызывают денатурацию белковой молекулы фермента, т.е. приводят к полной инактивации фермента.

Специфические и неспецифические ингибиторы

Использование необратимых ингибиторов представляет большой интерес для выяснения механизма действия ферментов. С этой целью применяют вещества, блокирующие определённые группы активного центра ферментов. Такие ингибиторы называют специфическими. Ряд соединений легко вступает в реакции с определенными химическими группами. Если эти группы участвуют в катализе, то происходит полная инактивация фермента. Диизопропилфторфосфат (ДФФ) относят к специфическим необратимым ингибиторам "сериновых" ферментов, так как он образует ковалентную связь с гидроксильной группой серина, находящегося в активном центре и играющего ключевую роль в процессе катализа.

Ацетат йода, п-хлормеркурибензоат легко вступают в реакции с SH-группами остатков цистеина белков. Эти ингибиторы не относят к специфичным, так как они реагируют с любыми свободными SH-группами белков и называются неспецифическими ингибиторами. Если SH-группы принимают участие непосредственно в катализе, то с помощью этих ингибиторов представляется возможным выявление роли SH-групп фермента в катализе.

Пример лекарственного препарата, действие которого основано на необратимом ингибировании ферментов, - широко используемый препарат аспирин . Противовоспалительный нестероидный препарат аспирин обеспечивает фармакологическое действие за счёт ингибирования фермента циклооксигеназы, катализирующего реакцию образования простагландинов из арахидоновой кислоты. В результате химической реакции ацетильный остаток аспирина присоединяется к свободной концевой NH 2 -группе одной из субъединиц циклооксигеназы. Это вызывает снижение образования продуктов реакции простагландинов, которые обладают широким спектром биологических функций, в том числе являются медиаторами воспаления.

Основные способы регуляции активности ферментов:

аллостерическая регуляция;

регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий;

регуляция путём фосфорилирования/дефосфорилирования молекулы фермента;

регуляция частичным (ограниченным) протеолизом.

Организация химических реакций в метаболические пути

Живая клетка - открытая система, при этом она стремится сохранить неизменным свой внутренний состав - клеточный гомеостаз . Метаболизм - совокупность всех метаболических путей, протекающих в клетках организма. Выделяют противоположно направленные процессы: катаболизм и анаболизм. Катаболизм - распад сложных веществ до простых с высвобождением энергии. Анаболизм - синтез из простых более сложных веществ. Метаболические пути согласованы между собой по месту, времени и интенсивности протекания, что обеспечивается сложными и многообразными механизмами регуляции .

Оптимальная активность ферментов, катализирующих реакции одного метаболического пути , достигается благодаря определённой пространственной организации в клетке.